蛋白表达纯化技术

原核表达基本知识介绍

一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达，就还需要考虑诱导剂的浓度；如果是融合表达，还需要考虑纯化系统或者蛋白标签的选择和检测等等问题。

选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上，表达载体 ：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合蛋白标签（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等等。

复制子：通 常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是 表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共 转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记：氨 苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素和氯霉素等等也是常见的筛选标记。抗性基因的选择要注 意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度， 温度过高容易导致抗生素失效。

启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR等等，T7是最常用的启动子。

组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。

诱导调控型表达：表 达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期蛋白过量表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶 对目标产物的降解。特别适合解决有对细菌有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。

融合表达：表 达载体的多克隆 位点上有一段融合表达蛋白标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的 蛋白标签（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择分子量较小的蛋白标签以减少对目的蛋白的影响。Trx-His是最常用的蛋白标签。

可溶性表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间表达，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体；而且表达产物如果是可溶的活性状态，那么蛋白就不需要复性。

分泌表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合蛋白标签有助于提高产物的可溶性。

转录终止子：对 外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用――控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可 以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是 rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。

核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意该现象。

表达菌株：我们往往最容易忽视的一点。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。同样，交换获得的免费表达用菌株，要注意其遗传背景是否已经发生改变；几个常用的启动子和诱导调控表达系统。

T7启动子：是 当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强 大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目 的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性 的影响；通过控制诱导条件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

有几种方案可用于调控T7 RNA 聚合酶的合成，从而调控T7表达系统。

    噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。
    另一种策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白对宿主细胞的潜在毒 性而造成的质粒不稳定。然后用λCE6噬菌体侵染 宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA 聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。
    此了噬菌体之外，还可以通过共转化质粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧浓度控制的启动子调控 T7 RNA聚合酶合成，据说这比较适合工业化发酵的条件控制。由于T7RNA 聚合酶的调控方式仍有可能有痕量的本底表达，控制基础表达的手段之一是培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。
    采用带有T7lac启动子的载体——在紧邻T7启动子的下游有一段lacI操纵子序列编码表达lac 阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色体上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 启动子并抑制其表达，也作用于载体T7 lac 启动子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。pLacI工转化也是同样的原理。
    更为严谨调控手段还有——在宿主菌中表达另一个可以结合并抑制T7 RNA聚合酶的基因——T7融菌酶，降低本底。常用的带溶菌酶质粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不会影响后继的表达质粒转化，前者表达的溶菌 酶的水平要比后者低得多，对细胞生长影响小，而pLysE会明显降低宿主菌的生长水平，容易出现过度调节，增加蛋白表达的滞后时间，从而降低表达水平。通 过几种不同方法来巧妙调控T7聚合酶合成，T7启动子发展出了史上功能最强大，最丰富的表达系统。