NEB常见问题

Q:NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，酶切失败或酶切不完全的原因及解决办法有哪些？
A: 1.酶失活，酶应贮存在-20℃，-70℃贮存会冻结，另外反复冻融会降低酶活性。通常可用已知多位点对照DNA测试该酶活性。
2.反应条件未优化，通常应按照推荐方法用限制性内切酶推荐缓冲液进行双酶切或分步酶切（均经过试验验证确认方法是优化的）。
3. 酶浓度过低，某些质粒或基因组DNA需要的酶量在10-20单位/ug。
4. 添加物缺失，解决的办法是重复操作，确保加入的酶或/和添加物（如BSA）
5. DNA浓度不适，NEB推荐50ul反应体系使用1ug DNA，过量DNA会导致酶切不完全。
6. 温育时间过短，某些酶对特定的位点切割速率较慢，绝大多数情况下1-2小时最够了。
7.DNA被抑制剂污染，将底物DNA与对照DNA一起消化，如果存在抑制剂，则对照DNA不会被切割，销量制备的DNA对抑制剂尤为敏感。若被抑制剂污染，可过柱纯化，层析，透析或增加反应体积降低抑制剂浓度。
8.识别位点不存在，需验证ＤＮＡ序列是否正确。
9.酶切位点被甲基化封闭，某些位点会被甲基化阻断，如果位点被阻断，应使用dam+/dam-菌株转化。另外真核基因组DNA可能被CpG甲基化阻断，可将其克隆到细菌宿主以消除影响。
10.DNA可能形成超螺旋，限制性内切酶消化超螺旋DNA效率是不一样的，需加大酶量。
11.识别位点过于接近DNA末端，一般在识别为点两端各加上6个保护碱基，确保切割效率。
12.位点优势效应，需要两个识别位点确保以达到有效切割。
 
Q:NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若出现非预期带型该如何解决？
A: 1.首先要确定正确的带型，通常将对照底物DNA与酶切产物凝胶电泳，部分消化会有相应未消化底物条带，星号活性会产生非预期条带。
2. DNA样品污染，应重新制备DNA样品。
3.DNA含有其他识别位点，验证DNA序列。
 
Q:NEB限制性内切酶进行DNA酶切时，若DNA电泳呈现弥散状该如何解决？
A:1.酶与DNA结合紧密未完全解离，在凝胶上样缓冲液或反应终止液中加入SDS至终浓度为0.1-0.5%以帮助解离。
2.核酸酶污染，操作时应注意避免交叉污染。
3.琼脂糖电泳条件不当，应使用新鲜缓冲液及合适电压，避免过热。
 
Q:什么是同裂酶？
A:识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶。第一个被发现的内切酶称之为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称之为同裂酶。
 
Q:NEB采用蓝冰运输的好处有哪些？
A:1.实验证明，使用蓝冰方法运输，既使到货时蓝冰已经溶化，泡沫塑料盒中的温度仍然能保持在4℃或4℃以下超过24小时。虽然NEB公司建议酶类产品贮存于-20°C，但在运输过程中，温度暂时维持在4°C至10°C之间不会对酶活性产生不良影响。事实上，在纯化这些产品的过程中，为了去除蛋白酶和其他可能影响酶稳定性的污染源时，所使用的温度就是4°C，并且纯化过程通常需要持续3周之久。此外，每种酶都贮存于NEB特定的贮存液中，该贮存液经过优化，对保持酶活的稳定性也会起到重要作用。
 
2.NEB产品贮存液中含有50％甘油，可以使酶在-35°C下保持液态。但是如果使用干冰运输，酶将被冷冻，如此反复冻融会导致蛋白质活性下降。
 
综上所述，蓝冰运输比干冰运输更能保证NEB产品的稳定性