ebioscience常见问题

Q:如何搭配流式抗体荧光标记?
A:流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。
 
Q:eBioscience公司提供了哪些荧光标记抗体？
A:eBioscien公司提供FITC,PE,PE-Cy5,PE-Cy5.5,PE-Cy7,APC,APC-Cy5.5,APC-Cy7,Cy5, PacificBlue®,andAlexaFluor®488,647and700等荧光标记抗体。另外还有更具优势的eFluor® 有机染料和eFluor® 纳米晶体(NC)标记抗体。如eFluor® 450，eFluor® 660，PerCP-eFluor® 710，APC-eFluor® 780系列产品已经完美替代 了Pacific Blue®， Alexa Fluor® 647，PerCP-Cy5.5和APC-Alexa Fluor® 750相关产品。
 
Q: eBioscience公司提供抗体浓度是多大？
A: eBioscience公司的提供抗体包括两种规格：ug和tests. 在ug规格的抗体中，亲和纯化、生物素标记、功能纯化生物素标以及FITC和Alexa Fluor® 488标记的抗体浓度为0.5 mg/ml；APC、PE、Alexa Fluor® 647,700和tandem标记的抗体浓度为0.2 mg/ml；功能纯化抗体浓度是1 mg/ml；而tests规格的抗体浓度标注在说明上，通常建议每test为20ul。
 
Q:流式细胞实验的对照应该如何设置？什么是同型对照？
A：①在应用流式技术检测细胞表面抗原时，我们通常要设的一个对照就是同型对照。同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。例如应用eBioscience公司的FITCanti-humanCD3：CatNo.11-0037，抗体亚型MouseIgG2a做流式染色；建议用FITCMouseIgG2a,KIsotypeControl：CatNo.11-4724作为同型对照。
②细胞因子的流式检测时，由于细胞经过了培养刺激活化的处理，为保证测得结果的准确性和客观性，除了同型对照外，还需另设置未刺激对照和刺激对照。未刺激对照：激活时由于BFA等的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA等阻断剂。激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
 
Q:间接免疫荧光标记法如何设置同型对照？
A:同型对照的目的是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，而确保检测结果的真实性。在采用间接免疫荧光标记法流式检测时，所设的同型对照是与一抗相同剂量、相同亚型和相同生物素标记（或纯化）免疫球蛋白，之后的荧光标记过程与实验检测组相同即可。eBioscience公司提供了各色标记和纯化的同型对照免疫球蛋白。
 
Q:为什么流式细胞术多色分析时要进行荧光补偿调整?
A:在进行流式细胞术多色分析时,待测细胞通常携带两种或两种以上的荧光素,如异硫氰荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻红蛋白(PECY5)等。这些荧光素被激光激发后发出不同波长的荧光,理论上每一种荧光通过选择恰当的滤光片可被相应的检测器检测到,而不受其他荧光的干扰。但目前这些荧光染料都具有宽发射谱性质,尽管它们的发射峰各不相同,但发射谱范围有一定的重叠,也就是说,相邻的检测器会检测到彼此的荧光信号,例如,FITC检测器会检测到少量的PE光谱,而PE检测器会检测到较多的FITC光谱。这样就影响了检测结果的准确性,因此,多色分析时必须进行光谱重叠的校正。
 
Q:如何检测胞内因子抗体的特异性？
A:可以应用过量的相应细胞因子先封闭该胞内因子的荧光标记抗体，或者先用不带荧光标记的相应因子抗体先封闭细胞，进一步流式操作作对照；另外同型对照也可以判断细胞的固定、破膜的效果以及非特异性背景的影响。
 
Q:为什么用CD452SSC设门法进行流式细胞术白血病表型分析?
A:免疫分型所用的样本通常是骨髓,由于骨髓中各种大小和分化程度的细胞均有,只根据细胞大小和颗粒密度很难将不同组分的细胞区分开。而造血系统细胞的CD45表达的荧光强度(FI)与细胞分化程度有一定关系,即分化程度高的成熟白细胞其CD45的FI也高,分化程度低的细胞其FI也低,而红系细胞的FI最低。在成熟白细胞中,各类细胞其 CD45的FI亦不相同,其中淋巴细胞和单核细胞的FI高于中性粒细胞。因此,根据各类细胞CD45的FI和颗粒密度不同,采用CD452SSC(侧向角散射)设门法可以将原始细胞(低FI,低或高SSC)、淋巴细胞(高FI,低SSC)、单核细胞(高FI,中等SSC)、中性粒细胞(低FI,高 SSC)、红系细胞(最低FI,低或高SSC)和细胞碎片(最低FI,最低SSC)清楚地区分开。
 
Q:在进行多色流式分析时，如何选择荧光染料标记抗体？
A:当我们在进行多色流式分析的时候，对分析成功的一个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。通常会有很多可行的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪比相差四到六倍都取决于荧光素的使用。高密度表达的抗原我们可以应用任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应用高信噪比的荧光素，大家可参照eBioscience的Best Protocols® Fluorescent Dyes Chart or our Fluorochrome Poster进行选择。
 
Q:流式分析时，是选择单克隆抗体还是多克隆抗体好？
A:荧光抗体的选择将直接影响流式检测的最终结果。荧光抗体的优劣由两方面的因素决定，即荧光素特性和抗体特异性。荧光素的选择如前所述。那我们侧重来看抗体选择对结果的影响。流式细胞术是抗体产品最重要的用途，而目前在流式细胞中应用的抗体则主要是单克隆抗体，单克隆抗体因其高度特异性、高灵敏度及高亲和力而比多克隆抗体有着明显的优势。
 
Q:我想购买eBioscience的流式抗体，我可以用什么抗体标记特定的细胞类型用于流式细胞仪分析？
A:使用eBioscience老鼠和人类的CD图表，以帮助确定您感兴趣的不同抗原的表达模式。
 
Q:流式细胞仪分析时如何区分活细胞和死细胞？
A:区分活细胞和死细胞可以使用7-AAD的活力染料（货号00-6993）或碘化丙啶（PI）染色溶液（货号00-6990）。 7-AAD或PI可与死细胞的细胞核结合，而活细胞的核酸将不会被染色。通过分析收集到的数据，就可去除死细胞。如需染细胞内蛋白质，可使用染料eFluor450，660或780。
 
Q:莫能菌素和布雷菲德菌素A有什么用处？
A:这些化合物能在细胞培养时激活胞内趋化因子和细胞因子表达，从而进行流式分析。莫能菌素（货号00-4505）和布雷菲德菌素A（货号00-4506）作为蛋白质运输抑制剂，能够抑制高尔基体细胞分泌的蛋白，从而导致内质网或高尔基体的细胞因子的积累。细胞通常在细胞培养时，添加这两种化合物质之一，以促进细胞内检测蛋白水平的积累。已知莫能菌素能阻止从内侧高尔基跨囊泡运输。布雷菲德菌素A已报道能够阻止从内质网的蛋白运输。
 
Q:请问能否震荡混匀抗体或重组蛋白？
A:并不推荐震荡混匀蛋白溶液(例如重组蛋白和抗体)以免改变其活性。另外在运输过程中会有液体散布在管壁上，建议使用前将抗体瞬离以获取最大体积。
 
Q:请问能否涡旋已经标记了抗体的样品？
A:可以。但不要时间过长(快速涡旋)，以免对细胞有损伤。
 
Q:eFluor® 有机染料和eFluor® 纳米晶体(NC)的区别是什么？
A:eFluor 有机染料 (eFluor 450, APC-eFluor 780, PerCP-eFluor 710, eFluor 710)是传统的荧光染料，而NC是纳米晶体/量子点，是纳米级的半导体颗粒，它具有与一般染料分子不同的荧光特性，纳米晶体发出的光的颜色主要取决于颗粒的大小。
 
Q:eFluor有机染料和eFluor纳米晶体染料有一致的缓冲液吗？
A:1.eFluor有机染料可使用传统荧光染料的流式染色缓冲液。2.对于eFluor纳米晶体，推荐使用的缓冲液货号为cat00-3222，经过验证发现，当使用PBS-based的缓冲液时，我们能看到微弱荧光，但若使用纳米晶体染色缓冲液（cat#00-3222），可明显增强荧光信号。
 
Q:eFluor有机染料和纳米晶体染料是否能用于胞内染色？
A:完全可以。
 
Q:用eFluor有机染料或纳米晶体染料都不能检测我的细胞信号，请问还有其他的选择吗？
A:根据你要分析的细胞来决定。如果细胞活力不重要的话，你可把染色的细胞样品避光储存在4度，或者冰上过夜，次日再检测。将样品用2%的福尔马林（PBS稀释）固定30分钟。对于固定的方法，建议将细胞重悬于100ul的eFluor纳米晶体染色缓冲液或100ul的eBisocienceIC固定液（cat#00-8222），孵育20-30分钟，然后用eFluor纳米晶体染色缓冲液（cat#00-3222）洗1-2次。固定完后，4度避光保存直至分析检测。
 
Q:为什么用APC-eFluor® 780替换APC-Cy7 和APC-Alexa Fluor® 750，用eFluor® 660替换Pacific Blue® with eFluor® 450 和Alexa Fluor® 647？
A:主要是由于APC-eFluor® 780的荧光强度高，补偿小，光稳定性高，故替代了APC-Cy7 和④APC-Alexa Fluor® 750。eFluor® 660同样是由于荧光强度高，补偿小，光稳定性高的特点替代④了Pacific Blue® with eFluor® 450 和Alexa Fluor® 647。
 
Q:eFluor有机染料能否冷冻？
A:eFluor有机染料和其他的有机染料一样不能冷冻。
 
Q:eFluor有机染料是否存在光不稳定性？
A:和其它染料一样，eFluor有机染料对光不稳定，建议尽量减少曝光时间。
 
Q:eFluor有机染料的激发光/发射光波长是多少？
A:eFluor有机荧光染料均是以发射波长来命名，因此根据有机燃料的名称就可知晓激发光/发射光波长，如eFluor® 450系列的激发光即为450nm。
 
Q:eFluor® 605NC, eFluor® 625NC and eFluor® 650NC标记抗体与其他荧光标记抗体的区别在于？
A:①补偿小。②高信噪比。③光稳定性强。④可与其他荧光染料同时使用。
 
Q:当使用eFluor® 605NC, eFluor® 625NC and eFluor® 650NC标记抗体时，需要考虑哪些因素？
A:①为了获得理想的荧光强度，建议不要使用PBS-based buffer 或 eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer (cat. 00-4222)，推荐使用eBioscience的eFluor® NC Flow Cytometry Staining uffer (cat. 00-3222)。
②细胞内染色：建议参照eBioscience Intracellular Staining protocol进行实验。③长期固定：不建议长期固定，而是建议在2％的甲醛固定30分钟。对于固定方法，建议方法为将细胞重悬于eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer和IC Fixation Buffer （cat#00-8222），孵育20-30分钟。洗净，用eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer (cat. 00-3222)洗1-2次。固定完后， 4度避光保存直至分析检测。
 
Q:eFluor® 605NC, eFluor® 625NC and eFluor® 650NC标记抗体可与其他荧光标记抗体共染色吗？
A: eFluor® 605NC, eFluor® 625NC 和eFluor® 650NC标记抗体可与eBioscience任何的荧光标记抗体共染色。但是由于eFluor 605NC ，eFluor 625NC以及PE-Texas Red的激发光波长相似，因此不能用于检测同一样品。
 
Q:检测eFluor® 605NC, eFluor® 625NC 和 eFluor® 650NC标记抗体时，如何选择激光？
A:尽管采用其他激发光源亦可使eFluor® 605NC, eFluor® 625NC 和 eFluor® 650NC发射荧光，但最好还是采用355nm或405nm激光，以获得最强的荧光信号。
 
Q:如何制备eFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer(cat. 00-3222)？
A:5XeFluor NC Flow Cytometry Staining Buffer需用蒸馏水稀释成1X。另在稀释时，需同时添加胎牛血清或其他同等的蛋白至终浓度为3%。4°C保存。
 
Q:eFluor 纳米晶体是否有毒？
A:除了eFluor 700NC含有无毒成分InGaP之外，其它所有的eFluor纳米晶体染料都含有不同浓度的重金属镉，锌和硒。镉具有潜在的毒性，因此需带手套处理。强烈建议使用eFluor纳米晶体染料需根据实验室重金属处理办法全程采取保护措施。请切记低剂量的镉可能不会有健康危险，但是一定不能长时间接触。
 
Q:如何处理eFluor纳米晶体染料？
A:除了含有无毒性的InGaP的产品外，eFluor纳米晶体染料主要是由镉组成的，因此建议根据所在地对含重金属物的处理规定来处理。