抗体的酶标记法

基本原理

本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。即通过应用单、双或多功能基试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶－抗体偶联复合物。不同的酶-抗体复合物制备方法中，最广泛应用的是第一步加入戊二醛的方法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。

试剂及仪器

l  亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸缓冲液 pH6.8）

l  用以标记的酶（EIA级，有商品供应）：

辣根过氧化物酶( HRP,纯度为A430/A275 > 3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶（AKP），或大肠干菌β－D－半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。

l  2５％戊二醛液（电镜级）

l  ０.1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.8）

l  PBS ( 见附录 )

l  2 mol/L 甘氨酸液

l  蒸溜甘油

l  透析袋 （分子量6000-8000）

l  电磁搅拌器和搅拌棒

操作步骤

一．抗体与过氧化物酶偶联

1． 将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；

2． 在4℃对0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）透析过夜；

3． 用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）稀释戊二醛至1%；

4． 向透析混合液中加入50μl 稀释过的戊二醛，在室温下轻1轻搅拌三小时；

5． 加入2 mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1 mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基

6． 混合液在4℃对PBS透析过夜；

7． 10000 × g 4℃离心30分；

8． 将上清移入另一管中，按体积1：1加入甘油，使终浓度达50%；

9． 置-20℃保存。

二．抗体与AKP偶联

1． 将5mg抗体与10mg酶在总体积2ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；

2． 其它操作同HRP标记法。

三．抗体与葡萄糖氧化酶偶联

按HRP偶联法操作，仅加入的1%戊二醛改为150 μl。

四．抗体与β－D－半乳糖苷酶偶联

按HRP偶联法操作，但见偶联反应总体积改为2ml，１%戊二醛用量改为的100μl。

反应质量测定

可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。（具体方法见-----）

实验要点及说明

１． 如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点，则在偶联反应中，被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏；

２． 主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在，游离氨基容易和戊二醛反应，因而干扰蛋白质的交连。因此，必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液，并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析，是反应成功的要点。

３． 反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。