免疫胶体金标记抗体及检测抗原

基本原理
 
胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物，可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定，但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金，可作标记二抗进行免疫检测，本方法应用范围广，染色后的样品可以长期保存。
 
试剂和设备
l         超速离心机
l         显微镜
l         温箱
l         分光光度计
l         0.2 um 微孔滤膜
l         载玻片，盖薄片,滤纸
l         氯金酸钠
l         1％ 柠檬酸钠水溶液
l         山羊抗鼠Ig抗体
l         对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体
l         自人外周血分离的白细胞悬液
l         10％氯化钠
l         1％ 聚乙二醇
l         0.01mol/L pH7.2的PBS
l         1% 戊二醛乙醇溶液
l         50％硝酸银溶液（提前一天配制）
l         明胶显影液，2g明胶溶解于99ml蒸馏水中，加1 ml甲酸
 
操作步骤
 
（一） 胶体金溶液制备
1．称取0.1g 氯金酸钠，溶解于1L去离子水中；
2．加热煮沸，剧烈搅拌下，迅速加入25ml新配的1％柠檬酸钠溶液；
3．继续煮沸5分钟，至溶液变成桔红色；
4．用蒸馏水将溶液的525 nm波长下的光密度吸收值调到 0.8。
（二） 胶体金的包被
1．  将山羊抗鼠Ig抗体以 36 900 ´g 离心30分钟；
2．  上清液经0.2 nm 滤膜过滤；
3．  确定蛋白质包被的最佳浓度：将蛋白质作连续10倍稀释各1ml，加入5ml胶体金溶液，1分钟后加入1ml 10％氯化钠溶液，静止5分钟；以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度，选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被。
4．  取50ml胶体金溶液，用0.2M K2CO3调pH值为7.6，按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合，让蛋白质吸附2分钟后，加0.5ml 1%聚乙二醇，防止非特异性凝集；
5．  5000´g 离心1小时，弃上清液，将胶体金悬浮于含 1％ 聚乙二醇的 PBS中；重复一次；
6．  弃去上清液，将包被的胶体金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀释, 经微孔滤膜过滤后，4℃保存。
(三) 抗原检测
1．  取20ul人外周血白细胞与5ml T淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟；
2．  1000 r/分离心清洗细胞5分钟，2次；
3．  将洗涤后的细胞与20ml(一般效价1:20)胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟；
4．  1000 r/分离心清洗细胞5分钟，2次；
5．  将细胞涂片于载玻片，用1% 戊二醛固定细胞10分钟，清洗多余固定液；
6．  将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中，加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液，覆以盖玻片，放入60-65℃的温箱中，显色3-4分钟，直至玻片标本呈现金褐色为止；
7．  移出盖玻片，用蒸馏水迅速漂洗数秒，晾干；
8．  光学显微镜下观察。
 
对照试验
 
  可以用未加一抗的细胞作为对照试验组。
 
试验要点及说明
 
1．  所使用的器皿均应非常洁净，需经过硅烷化处理；
2．  使用高纯度多次蒸馏去离子水；
3．  胶体金颗粒的形成、大小和速度，均决定胶体溶液的稳定性，水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要，本过程制备的胶体金颗粒直径约为18-20 nm；
4．  因为胶体金在电解质中不稳定，本实验全部操作过程要严格、迅速，注意液体颜色；
5．  蛋白质包被胶体金时的相对最佳浓度要事先测定，测定最佳浓度时，胶体金溶液的pH值也要调节到pH7.6；
6．  一抗和胶体金标记二抗的稀释浓度应事先经预试验以最佳效价。