mRNA分离（2）

 7）收集液置于透明的小溶器内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。

   经上述一轮oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的RNA中，带与不带poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA，可将洗脱液于65 ℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。
8）收集oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。
 
9）于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA，小心弃去上清液，用70 ％乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。
 
10）用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗
11）将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L， 混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。
i.OD260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml.
 
ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1－2％。