ELIspot常见问题分析
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问题
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可能原因
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解决方法
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背景高
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洗涤不充分
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显色前后将板子的两侧均洗涤，以防部分试剂漏出后导致背景
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板中PVDF膜没有充分干燥
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在读板前将板子放在4℃过夜有利于将斑点和背景分开，减少背景
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板孔中细胞数量太多或者分泌蛋白过多
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优化细胞数量和刺激剂用量
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显色时间过长
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实时检测显色过程，适时终止反应
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加入BCIP/NBT显色后，双蒸水清洗，兰黑色的背景和斑点衰减
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PVDF膜是湿的
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在PVDF膜完全干了以后再进行分析：将板放置37℃ 15－30分钟或室温60－90分钟即可完全干燥
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板孔中斑点数量多而阳性对照孔很少
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孵育不完全
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可能碱性磷酸酶－链酶亲和素和BCIP/NBT显色液没有平衡到室温，使用之前将所需试剂平衡至室温
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板孔中斑点密度太高
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板孔中细胞数量太多
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建议备比稀释细胞，确定最佳细胞数量
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包被抗体过多
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减少包被抗体用量
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细胞刺激过度导致分泌蛋白过多
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减少刺激剂的使用，缩短刺激时间
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板空里的斑点数量比预计要少而阳性对照孔正常
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细胞刺激不够
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保证用来刺激细胞的刺激剂具有很好的生物学活性：可在刺激完成后通过免疫细胞化学来鉴定刺激效果。延长并优化刺激时间
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板孔中细胞数量太少
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增加细胞数量
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抗体用量不够
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增加包被抗体和检测抗体的用量并进行优化
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显色不充分
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实时检测显色过程，确定所用显色剂是否失效
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孔中间出现空白
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膜被破坏
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更轻柔的操作和洗涤，不建议使用洗板机
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孔中出现空白区域
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膜没有预处理
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确保膜用70％乙醇浸润，随后使用PBS洗涤3次
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操作过程中出现干膜
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确保检测过程中膜不会出现干燥现象
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细胞分布不均匀
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将细胞混匀后再加入孔中，在刺激孵育过程禁止移动板子
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假阳性（使用培养基空白对照可以确定是否有假阳性）
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二抗聚集
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使用前过滤二抗
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膜上有残留细胞存在
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刺激后充分洗涤，保证没有细胞黏附在膜上
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细胞污染了
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尽可能保证所用试剂是清洁的，细胞培养用品是无菌的
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斑点聚集分界不清
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膜没有预处理
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确保膜用70％乙醇浸润，随后使用PBS洗涤3次
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细胞聚集了
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在刺激孵育过程禁止移动板子
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