固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）

简介ELISPOT技术

       ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。

 

与ELISA的区别

        ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：

        1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。

        2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个活性细胞，从而计算出分泌该蛋白或者细胞因子的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）

        3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。

        4、捕获抗体为瑞典高科技生物公司MABTECH, BD、R&D、生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

 

ELISPOT检测原理

    细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

 

ELISPOT应用范围

   移植研究 – allograft rejection

   疫苗开发 -亦可评估疫苗效力，或是疫苗注射路径影响

   Th0/Th1/Th2细胞转换分析

   自体免疫研究 – 免疫调节及免疫治疗研究

   癌症研究 -肿瘤反应T细胞作用

    过敏机制探讨 – IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与过敏机制之细胞激素研究

   传染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

   抗原决定位定图

   体液免疫力研究 – B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究

 

ELISPOT技术优势

        1  最低至1：100万细胞精度的活体外频率测量。这种分辨率已经远远超过使用细胞内细胞因子的四聚物染色和 ELISA 法测量的精度。这种高敏感度是非常关键的，因为抗原特异性 T 细胞在体外都是典型性的低频率。

        2  高产量 T 细胞分析成为可行。一个经过训练的相关实验室小组可以测试成百的样本中几十种抗原的反应。

        3  只需要少量细胞，就可以用于通其他细胞学分析方法进行比较。例如，45毫升的血液就足以用于测试600种不同抗原/肽类物质的反应。

        4  可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。这是因为只需要少数细胞，分析就可以在高产量模式下进行。ELISPOT 分析在筛选肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工具。

        5  用于确定抗原特异性 T 细胞的功能性亲和力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的影响。

        6  可以用于研究未经药物处理过的细胞的分泌过程。如果观察到净产量减少，可以确定这种区别是来自于分泌细胞的减少，还是每个细胞分泌产量的减少。

        7  淋巴细胞在 ELISPOT 分析后依然存活。这使得分析之后进行增值，用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。

        8  低温储藏后的人类淋巴细胞可以用于检测，而不会丢失其功能。治疗前和治疗后的样本可以并排进行测试，结果可以重复。