免疫组化技术要点和常见问题
免疫组化技术要点和常见问题：
在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组），所有操作过程应完全一致。
染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:
可能原因
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解决办法
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试剂使用顺序错误或者漏加试剂
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重复实验，保证每一步均正确
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二抗和一抗不匹配
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选择匹配的二抗
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底物和酶不匹配
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选用匹配的底物
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酶失活
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换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？）
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组织中没有待测抗原表达或者表达水平低
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使用阳性对照片
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抗体浓度太低
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增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度
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抗体孵育时间不充分
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延长抗体孵育时间
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底物孵育不充分
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延长底物孵育时间
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抗体储存不当，导致失效
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将抗体分装，低温保存 (-20℃ to -70 ℃) ，避免反复冻溶。稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。或者根据说明书进行恰当的保存
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一抗失效
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换用新的一抗
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二抗失效
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换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）
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脱石腊不充分
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延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
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组织固定不充分或者不当
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增加固定时间或者改用不同的固定方法
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组织固定过度
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减少固定时间。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法
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复染试剂与底物系统不匹配
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选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有组织染色？）
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封片剂不正确
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选择正确的封片剂
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染色背景高:
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可能原因
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解决办法
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洗片不充分
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每步之间至少洗片3次
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组织含有内源性的酶，如HRP/AP
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在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统
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组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾）
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在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？)
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一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高
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增加一抗的稀释度
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二抗和组织非特异性结合
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使用与二抗来源相同的正常动物血清（一般是10％）封闭，必要时可以将血清浓度加大
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组织固定不充分，抗原扩散
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Increase duration of postfixation
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使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织
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在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂
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干片
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染色过程中避免出现干片现象
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染色强度过大:
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可能原因
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解决办法
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一抗或者二抗浓度过高
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降低抗体浓度。或者使用不同的浓度，决定最佳染色浓度
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孵育时间过长
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减少孵育时间
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孵育温度太高
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降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者RT
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底物孵育时间过长
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减少孵育时间
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干片
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染色过程中避免出现干片现象
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