免疫共沉淀实验成功3大关键

一、个人总结的成败因素：

1. 有效裂解细胞。

2. 恰当选择处理样本的方式：超声或酶处理。

3. 选用适当适量抗体。

4. 恰当设置对照。

5. 不要过分交联DNA-蛋白质。

6. 交联所用的甲醛终浓度约为1%，交联时问需要预实验来确定。

7 . 注意PCR策略具体来说：恰当设置ChIP实验对照，设置适当的阳性和阴性对照是进行ChIP结果分析的重要步骤和Trouble shooting的依据，因为非特异性的免疫沉淀难以避免。

一般的设置方法

1 未经免疫沉淀的超声处理后样本( INPUT)。

2 加特异抗体来源动物的正常血清或无关抗体(MOCK)。

3 阳性对照引物的应用。

4 选择不与目的蛋白质结合的基因组区域作对照。

如 阳性对照抗体 (Anti-acetyl-Histone H3)

* 阴性对照抗体 (Normal Rabbit IgG)

* PCR引物 (control primer specific for human GAPDH)

二 、抗体选择，尽可能选择试剂公司验证过的CHIP级抗体，如upstate公司。

与目的蛋白比，抗体应过量，预实验确定抗体用量，选用高质量高滴度抗体。

抗体识别位点不是DNA-Pro结合的位点。

三、ChIP耗时长，什么时候能够停止并且冷冻样本?

I. 甲醛固定和冲洗以后离心下形成的细胞球状聚合体。

II. 细胞溶液(lysate)。

III. 声波裂解染色质后。

IV. 在逆转交联后。