抗体的荧光标记法

基本原理
 
许多蛋白质分子在其表面含有较多的赖氨酸残基。这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC（其激发波长为492nm, 发射光波长为525nm）共价结合。与FITC结合的抗体可用为特异性的探针，以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶联物的稳定性很好。FITC是应用最广的荧光染料，流式细胞仪就按FITC的特性，设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm）。
偶联反应是在pH 9.8条件下，赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应，由此形成硫脲连接。
 
试剂及仪器
 
l         待偶联抗体
l         碳酸氢钠缓冲液：25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制，配法见附录)
l         PBS (见附录)
l         叠氮钠（有毒试剂）
l         异硫氰酸荧光素（I型异购体，有商品供应）
l         电磁搅拌器
l         铝铂
 
操作步骤
 
１． 用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；
２． 将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；
３． 上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次，直致480nm 的吸收为零；
４． 加入0.5g/L 的叠氮钠。此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－2０℃冻存。
 
荧光偶联质量的检测
 
用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。
或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定：
取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查 FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A280 1.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的μgFITC的比值，可以此鉴定及比较各批标记物的质量。
 
实验要点及说明
 
１．  偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；
２．  要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）；
３．  FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为０.3－１.0（方法见前）；
４．  FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；
５．  如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰；
６．  如果被标记的蛋白质是第二抗体或通用的第一抗体，则从商品购置可能更方便可取。